Tujuan :
Untuk mengenalkan teknik high performance liquid cromatography, termasuk operasional dasar instrumen dan mempelajari pengaruh pengaturan sejumlah parameter.
Pendahuluan
HPLC adalah metode kromatografi yang menggunakan fase gerak cair dan fase diam padat / bahan pendukung untuk melakukan pemisahan suatu jenis molekul. Terdapat dua variasi utama yaitu, HPLC yang terdiri dari eluen polar dan fase diam non-polar atau eluen non-polar dan fase diam polar. Keduanya diklasifikasikan sebagai metodereversed-phase dannormal-phase. Metode reversed-phase yang akan dipakai dalam eksperimen ini menggunakan kolom octadecylsilane (ODS) dan partisi absorptif (dapat menyerap) utnuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
Syarat pemilihan utama setelah memilih metode HPLC yang sesuai adalah menentukan sistem pelarut untuk analisa. Kriteria pemilihan melibatkan waktu analisa, (tR atau k'), efisiensi keseluruhan (jumlah plate, N atau n), atau mungkin resolusi (Rs). Percepatan aliran eluen akan memainkan peranan dalam parameter ini, akan tetapi pemilihan yang bijaksana atau optimisasi komposisi pelarut akan diperlukan.
Polaritas pelarut adalah dasar yang berguna untuk menentukan bagaiman nilai k' dapat diubah, dan tentunya akan mengubah waktu analisa. Untuk menggunakn parameter ini, maka sangatlah penting untuk mengukur polaritas pelarut dan hubungkan dengan k'. Dapat dilihat seperti dibawah ini :
Indeks Polaritas dari Pelarut Terpilih
Indeks polaritasdari campuran dua pelarut akan diberikan sebagai :
P'ab = ØaP'a + ØbP'b
dimanaØ = fraksi volume tiap pelarut.
Sebuah aturan yang berguna bahwa untuk setiap perubahan polaritas dua unit terdapat perkiraan 10 kali lipat perubahan dalam rasio partisi (faktor kapasitas) k'
Darihubungan ini dapat terlihat bahwa k'=64 dalam 30/70 MeOH/pelarut air, kemudian komposisi pelarut yang mana akan memberikan nilai k' =5 dalam 73/27 MeOH/aiir
Prosedur
A.Operasional Kromatografi Cair
Catatan : Jangan pernah membiarkan pompa beroperasi tanpa filter pelarut terendam dalam pelarut
Pilih panjang gelombang UV-sinar tampak dan nyalakan detektor untuk standby. Setelah 1 menit nyalakan detektor ke posisi ON. Pengaturan 0,04AUFS akan cukup.
Jika pompa belum dinyalakan, pertama pilih solvent line yang diperlukan (solvent select dial) dan keluarkan solvent line dengan gambar sekitar 20 mL pelarut keluar melalui flush outlet (berada dibawah solvent select dial). Lakukan ini dengan menggunakan syringe, masukkan dalam outlet, buka katup dan keluarkan solvent. Tutup katup kembali.
Pada saat pelarut telah terpilih dengan tepat, turn on pompa dan secara perlahan naikkan laju aliran pada level yang diinginkan. Tunggu sekitar 15-20 detik antara tiap kenaikkan dalam pengaturan aliran. Bila aliran telah di-set, tunggu paling tidak 15 menit agar kolom menyesuaikan dengan pelarut yang baru sebelum menginjeksikan sampel.
Bila aliran pelarut diubah pada saat running, misal dari 0,8 ke 1,2 mL/menit, lakukan pengaturan ke aliran yang baru dengan perlahan dan tunggu 5-10 menit hingga stabil.
Jika aliran pelarut harus dihentikan, kurangi 'thumbwheel setting" dengan perlahan ke angka nol, dan switch off pompa. Pada saat ini, pelarut dapat diubah ke pilihan selanjutnya.
Melakukan Injeksi : Semua volume injeksi yang akan dilakukan adalah 10μL. Bilas syringe beberapa kali dengan pelarut dan sampel sebelum mengambil 10μL aliquot. Pastikan tidak terdapat gelembung udara dalam tabung syringe yang mungkin masuk. Putar katup injeksi ke "load", putar retaining arm kebawah untuk melepas plug stopper dan cabut plug. Masukkan jarum syringe ke dalam injection loop dan injeksikan larutan. Kembalikan plug, putar retaining arm untuk mengencangkan plug, dan selesaikan injeksi dengan cara memutar katup ke posisi "inject". Pencatat (recorder) akan start secara otomatis.
Pengaturan recorder : Menggunakan Shimadzu recorder. Atur speed pada 5, dan attenuation pada 3.
Shut-down procedure : Pada saat kromatogram terakhir telah terekam kolom sebaiknya dikembalikan ke kondisi yang sesuai untuk storing, yang mana ini berarti kolom harus disiram dengan 50/50 MeOH/air pada 1 mL/menit selama sekitar 20-30 menit dan kemudian laju aliran dikembalikan ke nol. Maka ganti dengan pelarut ini dengan mengguankan prosedur sebelumnya dan lakukan seperi diatas.
B.Studi Kromatografi
Dua sampel yang akan dianalisa ;
SAMPEL 1:Uracil dan acenaphthene
SAMPEL 2:Naphtalene, phenanthrene dan anthracene
Uracil umumnya dipakai untuk menunjukkan kekosongan volume atau waktu untuk puncak yang tidak tertahan (to), dan akan mengelusi layak dengan cepat. Hal ini akan membantu dalam perhitungan nilai k'. Phenanthrene dan anthracene elute sebagai sepasang puncak yang berdekatan, sehingga akan berguna jika kita akan memperkirakan resolving power dari suatu kolom. Berikut eksperimen yang akan dilaksanakan :
Tetapkan aliran dari 60/40 acetonitrile/air pada 0,8 mL/menit
- Injeksikan 10 μL air. Catat "water dip"
- Injeksikan 10 μL acetonitrile. Catat respon yang terjadi
- Injeksikan 10 μL sampel 1 Naikkan laju aliran ke 1,2 mL/menit
- Injeksikan 10 μL sampel 1 Naikkan laju aliran ke 1,6 mL/menit
- Injeksikan 10 μL sampel 1
- Injeksikan 10 μL sampel 2 Ubah pelarut ke 75/25 acetonitrile/air dan laju aliran ke 1,6 mL/menit. Biarkan kolom untuk menyeimbangkan.(Catatan : Periksa dengan asisten lab sehubungan dengan perubahan pelarut)
- Injeksikan 10 μL sampel 1
- Injeksikan 10 μL sampel 2
Bila semua prosedur di atas telah diselesaikan, lakukan prosedur shutdown.
Perhitungan dan Pertanyaan
- Untuk setiap kromatogram sampel 1, hitung k', total plates (n, N), tinggi plate (h,H) dan tinggi reduced plate.
- Untuksetiap kromatogram sampel 2, hitung nilai k', dan resolusi (Rs) dari pasangan puncak yang berdekatan.
- Hitung asimetri puncak dari acenaphthene dalam satu kromatogram (ditentukan dengan mengambil rasio jarak dari peak maximum, atau mode, ke trailing edge puncak, jarak dari peak mode ke leading edge puncak, pada 10% tinggi puncak) Ini mungkin akn berguna untuk penyimpanan kemampuan dari recording inegrator sehingga puncak dapat dinalisa kembali pada chart speed yang lebih cepat untuk pengukuran akurat dari jarak yang terlibat. ( Acuan pada diagram di bawah).
- Beri komentar pada pengamatan dari "solvents dip".
- Beri komentar tentang bagaimana k' bervariasi dengan laju aliran dan komposisi pelarut. Apakah k' bervariasi sesuai dengan yang Anda harapkan ?
- Beri komentar tentang bagaimanaefisiensi bervariasi dengan laju aliran.
- Beri komentar tentang bagaimana Rs bervariasi dengan komposisi pelarut, dan nyatakan bagaimana Rs mungkin bervariasi dengan laju aliran.
- Bandingkan dengan teliti hasil yang diperoleh dalam eksperimen 5 dan 7, berkenaan dengan area puncak dan tinggi puncak dari uracil dan acenaphthene. Jelaskan pengamatan Anda. Aplikasikan alasan Anda pada perbandingan hasil dalam eksperimen 6 dan 8.
- Apakah Anda percaya bahwa uracil merupakan bahan terlarut
(solute) efektif untuk estimasi ?
